內毒素的分離提取和純化方法介紹

Boivin和Messrobeanu于1935年，將活菌或經冷凍干燥的大腸桿菌，在4℃條件下與0.25N的三氯醋酸共同振蕩或劇烈攪拌，將細菌細胞裂解，使LPS分子從破潰的細胞外膜上游離出來。離心后取上清液經濃縮后，加2倍體積的冷凍乙醇，將生成的沉淀物溶解、濃縮后冷凍干燥，即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌體蛋白，這些蛋白質可影響LPS的理化性質和生物學活性。

（二）酚-水法

wesphal和luederitz于1952年為分離含蛋白質較低的LPS而建立的方法，以后被廣泛應用于水溶性S-LPS的提取。具體過程為：在細菌的水溶液中，加入等量90%的酚將細胞裂解，使內毒素分子從破潰的細胞外膜上游離出來。68℃，振蕩10～15min后，冷卻、離心，收集富含LPS的水相，并反復用水萃取3～5次，然后將水相濃縮、冷凍于燥，得到粗提的LPS，將粗制品溶解于水，高速離心（100000g，2～3h），得到顆粒狀LPS后再溶于水中冷凍干燥。此法提取的LPS純度較高，蛋白質含量為1%~3%。

由Galanos設計的提取R-LPS的方法。預先經乙醇、丙酮、乙-醚脫脂后的干燥菌，用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所組成的混合提取液提取2～3次，取酚相，得到LPS和孔蛋白（porin）提取液，用減壓法去除溶媒，加水形成沉淀，并洗滌3～5次，然后再用80%苯酚復溶，減壓干燥，得到的LPS粗制品溶于水，超速離心取沉淀，即得到LPS純品。此法純化得到的LPS，不含核酸和多聚糖，蛋白質含量可控制在1%以下。

由Morrison等于1975年設計。水-丁醇法較酚法簡便，溫和，適用于提取大腸桿菌和沙門菌的LPS；所得制品含蛋白量約1%。但此方法仍存在一些不足，由于丁醇不能滅活制品中酶類，導致在制備過程和儲存時，Lipid A常發生降解。

二、純化
 

（一）離子交換層析法

利用陽離子樹脂非特異性的吸附帶負電荷LPS的性質，將LPS從流動相中分離純化出來。

利用多粘菌素B特異性結合LPS的特性，將多粘菌素B包被于聚丙烯胺樹脂等高分子聚合物的表面，制成特異性結合LPS的層析柱，即可對LPS進行親和層析法純化。

通常情況下，未提純的LPS溶液中存在大量的小分子帶電物質，如Mg²⁺ 、Ca²⁺和少量的Fe²⁺ 、A1³⁺、Zn²⁺、Na⁺等離子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亞精胺及尸胺等小分子量多胺。它們中和LPS分子上帶負電荷的磷酸基團，使得本可以用帶電荷的吸附劑將LPS除去的效果明顯降低。電透析便是通過離子交換的方法進行LPS純化的。其原理就是將很多的陰/陽離子交換膜交錯地串聯在一起，電解質溶液則在膜間流動，兩側施加直流電之后溶液中陽離子（如無機陽離子、生物堿等）向陰極移動而陰離子（如無機陰離子、有機酸等）向陽極移動。其中陰離子可順利通過陰離子膜，但再往前移動時卻被鄰近的陽離子膜擋住。同樣，陽離子也可以順利地通過陽離子膜而無法通過陰離子膜。中性化合物及高分子化合物則留在透析液中，最終得到純化的提取物（圖2-6）。

由于提取的LPS中含有較多帶正電荷的雜質，因此在LPS的電透析過程中可發現陰極的pH值升高，陽極的pH值變化不明顯的現象。電透析過程中LPS溶液的pH值常有一定程度的下降，同時由于有穩定LPS多聚體功能的Mg²⁺ 、Ca²⁺等離子成分被除去，LPS多聚體變為單體而發生沉淀。為避免此現象，需用NaOH或三乙胺將其中和到pH 7.0左右，使其形成中性的、高水溶性的LPS鈉鹽和LPS三乙胺鹽而重新溶解。電透析結束時，LPS一般為酸性產物，此酸性LPS在水中的溶解度極低，可直接進行凍干處理，-4～-20℃低溫保存，每次使用前可用不同的堿中和轉化成所需要的LPS鹽。

根據LPS與核酸片段在分子量上的差異，可用超速離心法、電泳法等方法將其去除。