鱟試驗法中鱟試劑及內毒素的標化問題

一、鱟試劑的標化問題

鱟試劑為鱟變形細胞的細胞溶解物，制備時可采用裂解法和機械方法使細胞破裂。鱟試劑的敏感性可受到動物個體差異、季節差異及生產工藝過程中不穩定因素的影響。因此各批次間，其敏感性差異很大。即使是同一批試劑，由于操作、保存方法、環境因素等影響，其敏感性亦不一樣。鱟試劑在液態時極不穩定，往往很難保存。貯存于4 ℃冰箱，其活性一般于4~5月開始下降，8個月左右*失活。冷凍保存的穩定性稍高于液態保存。`真空凍干粉劑保存為目前最-好的方法，- 30℃保存其有效期可達2年。

改善生產工藝，控制制劑中的參數，可使試劑的敏感性和穩定性增高。國內丁友玲等報道，鱟試劑含水量控制在5%以下，總蛋白量控制在5mg/ml以上，Ca⁺⁺、Mg⁺⁺控制在0.01~0.1M，可使鱟試驗的穩定性提高，重演性增強。

試驗前，應以WHO標準內毒素作標定，如試劑敏感性為1ng/ml或小于1ng /ml，則認為是敏感的，可以應用。美國制備了參考鱟試劑，各種鱟試劑在應用前與其比較，可獲得相對效力。

除應解決好鱟試劑的標化問題外，對鱟試劑的操作程序亦應標化，因為操作上微小的差異即可使試劑的敏感性改變。

二、內毒素的標化問題

從各種細菌制備的內毒素，或以同一種細菌制備的內毒素，或內毒素批次間、批次內，其活性均可不一致。所以應用LT法（鱟試驗法，Limulus test）檢測內毒素時，需要一個標準的內毒素作為對照參比。

大腸桿菌內毒素在各種細菌內毒素的LT反應上處于中值的位置（圖4），且其穩定、可溶，因此將大腸桿菌內毒素作為參考標準內毒素(Reference Standar d En-dotoxin，RSE)是較為適宜的。

根據以上理由及原則，美國FDA下屬的生物制品管理局(BOB)組織了大規模的研究。制備了一系列標準參考內毒素（表4）。分別命名為16、EC、EC-1，EC-2………，EC-5。其中EC-2是以大腸桿菌O₁₁₁B₄。(Braude株）提取的，各項指標均為滿意。

日本從大腸桿菌UKTB中提取了內毒素，作為日本的標準參考內毒素，采用酚水抽提法，然后再用乙醇沉淀?；瘜W分析、熱原性及鱟試劑激活性*符合RSE的標準。且其在干燥狀態下穩定性極-好，可長期應用，但如溶于水，則穩定性可下降。

最近美國藥品部門已向WHO提供了一批新的RSE，供國際上檢測時作為參比用，這使LT試驗結果容易統一。實際上WHO對此早就組織了合作研究，包括多種鱟試劑及內毒素。

從理論上講，一種RSE需滿足下述條件：①干燥制劑；②在性質是可用的；③在室溫下穩定；④吸濕性少；⑤易溶于水；⑥在水及生理鹽水中清澈；⑦可致家兔及人反應；⑧須從常見的菌株提取。

但目前所有RSE均不*符合上述條件，因此，有關內毒素的標化問題仍須進行深入的研究。

具體檢測時，各實驗室可采用對照標準內毒素（Control Standard Endotoxin，CSE)，但其效能必須先以RSE進行標定。CSE效能的計算公式為:

CSE效能=GM比值×E  Eu/μg

其中GM比值為算術平均值，E為RSE的效能，常為6000Eu/管，CSE與 RSE作平行的LT試驗，試管數N應大于16，然后算出CSE與RSE相應的比值R₁，R₂，……R_N，將這些比值換算成以10為底的對數值，然后計算平均和標準的SD，平均SD的反對數即為GM比值。

1981年9月美國、日本、英國、西德、瑞典、意大利六國學者及監定部門的代表在美國Woods Hole 海洋學院召開了用于注射用品的鱟試劑和內毒素標準的國際會議，會上Difco實驗室的Fleishman報告了“自多種革蘭氏陰性菌內毒素的LT法檢測熱原的比較”一文，提出了被檢內毒素相對活力的概念，即與參考標準內毒素（EC-2）比較后的相對活力，計算公式如下圖:

其中5 Eu/ng是FDA標準內毒素EC-2的指-定活力。