熒光測定法檢測細菌內毒素含量的方法介紹

鱟試驗法中，有不少方法可以檢測細菌內毒素含量，其中一種就是熒光測定法。

那熒光測定法在試驗中是怎么進行操作的呢？

首先需要將熒光母素和鱟試劑充分混勻，這樣蛋白分子在進行凝膠反應的同時，熒光素就可以將其標記上。

在凝膠逐漸形成的過程中，蛋白分子的聚合結構也會慢慢發生變化，與此同時，與熒光素結合的蛋白因子也會跟隨水分子的運動從而進行同步旋轉，使得熒光的偏光度會發生變化。這時，我們將熒光的偏光度設為P，垂直的熒光強度設為I1，水平的熒光強度設為I2,,然后可以看得出，P值會因為凝膠的凝固程度而發生變化，這個時候想要求出其中的值，可以根據下圖公式計算得出：

根據此公式可以得出，P值和供試品中的細菌內毒素含量為線性關系。

在進行鱟試驗時，熒光母素的常用濃度一般為0.02%，若熒光母素的濃度超過0.05%以上，蛋白分子的聚合結構就會受到抑制，發生明顯的變化，而熒光母素的濃度在0.025%時，蛋白分子的聚合結構會受到輕微抑制。所以，我們一般選定熒光母素的常用濃度為0.02%。

鱟試劑在凝固的過程中會隨時影響P值得變化。當凝膠逐漸凝固時，P值就會越來越大，而內毒素的濃度又決定了鱟試劑凝固的反應期的時間長短和P值的增大變化。

當內毒素值為10-2μg/ml的時候，P值就會在五分鐘內開始產生增大的變化；若內毒素值在10-3μg /ml的時候，P值在30分鐘時都不會又明顯增大的變化；又若是內毒素值在<10-3μg /ml的時候，因內毒素的濃度值過小，鱟試劑凝固的反應潛伏期就會越長。這個時候就能根據P值的上升程度繪制出圖像，從而得出回歸直線方程值。

這時，我們設傾斜度為b，潛伏期為t ，計算出b/t值。根據熒光母素濃度的不同計算出標準內毒素的值然后繪制成曲線圖像，可以得出內毒素含量在10-8～10-3μg /ml范圍時，整體是呈上升直線狀的，可以得出相關系數：0.9804

由此列出方程式： 

Y = 0.0207 + 0.0797x，其中 (R = 0.9804)

由此標準曲線可以得出供試品中的細菌內毒素含量

需要注意的是，熒光測定法的試驗操作均在0℃的環境中進行操作，在進行60分鐘靜置時，還需時刻觀察試驗的反應過程，然后每5分鐘就需要進行一次測定。

總而言之，熒光測定法需謹慎、耐心，方可得到準確的結果。