選擇性清除內毒素的最佳吸附條件

圖35-3顯示了從蛋白質溶液中吸附內毒素的原理。陰離子交換配體和一切內毒素選擇性配體在工作條件下帶正電荷網，如此，帶負電荷的蛋白質和內毒素在低離子力時被吸附，此時蛋白質和內毒素幾乎不能回復。當吸附能力耗盡之后（不取決于是否系內毒素特異性），蛋白質的回復便可接近100%。所采用配體的結合位點的多少對蛋白質和內毒素來講是一樣多的，所以蛋白質和內毒素對這些結合位點的競爭影響了內毒素的清除。同樣，對于一些已經被吸附的內毒素來說，在蛋白質濃度比內毒素濃度高出6個數量級的情況下也是可以被取代下來的。

另一方面，內毒素和帶陽離子電荷網的蛋白質形成復合物以致親和配體和蛋白質競爭內毒素，如果在吸附劑表面的電荷密度高或者使用一種選擇配體，使得平衡傾向于吸附劑，則可使內毒素得到去除。當帶陽離子電荷網的蛋白質從陰離子交換劑上解脫時，能得到幾乎100%的蛋白質。

迄今為止，以上所提及的吸附劑沒有一個已被實際用于蛋白質溶液的內毒素清除。但是，離子力起到了重要的作用，特別是在吸附過程的最初階段。低離子力的物質，相當于小于50mmol/L的NaCl，常被推薦用作離子交換劑。具有較高離子力的物質如多黏菌素B和DAH，在被用作親和吸附劑時，與配體的結合主要依靠離子間作用力和疏水作用。在合適的條件下，其關系常數超過109。多陽離子配體較少依靠離子力。蛋白質的去污染與其在環境條件下的等電點及pH值穩定性有很大的關系。一般來說，當pH值接近蛋白質的等電點時，內毒素能最大限度地被去除。強堿或強酸性蛋白質的化學特性使其在純化時發生不可逆的丟失，而且沉淀反應也是一個問題，所以必須尋找一個折中的辦法。對于酸性蛋白質而言，環境pH值應該盡可能接近PI，同時應該采用多聚的或疏水性弱的配體。等電點接近7的蛋白質應該在pH≈PI的環境下進行去污染。雖然用內毒素選擇性配體能得到更好的結果，但陰離子交換劑也可以采用。離子交換劑對堿性蛋白質的去污染結果也相當不錯，特別是帶有4條氨基酸基團的配體，它在堿性條件下能顯示出較高的離子密度，并在提高pH值后與內毒素的吸附相當匹配。

應該注意到，不僅僅是帶凈電荷的蛋白質，也包括所有陽離子配體，其電荷密度隨著pH值的改變會發生變化，但除外那些有4條氨基酸的配體。pH值的升高可導致電荷密度的減少，具體數值可因配體的pK或pI而有差別。

如果內毒素和帶負電荷的蛋白質之間的作用是由Ca2+介導的，則應該輔以1～5mol/L的EDTA。EDTA是一種強螯合劑，可使蛋白質-Ca2+-內毒素復合物的平衡傾向于解離，由此增進吸附劑的去污效果.此外，如果要采用輔以3-吡喃氨基葡萄糖或其他不帶電荷的去污劑，則應事先篩選，因為在應用這些物質時會帶來其他問題。

評價層析柱在耗盡其蛋白質結合能力之后留在柱里面的內毒素的量是十分必要的，這在部分吸附時也是一樣的道理，即蛋白質或內毒素濃度的變化會同時影響到清除效率和蛋白質的回收。